Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger

Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger

Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger là một trong những kỹ thuật nền tảng và kinh điển trong sinh học phân tử, từng là tiêu chuẩn vàng để xác định trình tự DNA. Mặc dù ngày nay công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) đã phổ biến hơn, phương pháp Sanger vẫn giữ vai trò quan trọng trong các ứng dụng yêu cầu độ chính xác cao như xác nhận đột biến, chẩn đoán bệnh di truyền và nghiên cứu gen mục tiêu.

Lịch sử phát triển của phương pháp Sanger

Phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger được giới thiệu vào năm 1977 bởi nhà hóa học Frederick Sanger. Ông đã nhận được giải Nobel Hóa học lần thứ hai nhờ công trình này. Từ đó, kỹ thuật Sanger đã trở thành nền tảng cho việc giải trình tự toàn bộ hệ gen người và hàng loạt các nghiên cứu gen khác.

Cơ sở lý thuyết của phương pháp Sanger

Phương pháp Sanger dựa trên nguyên lý sử dụng các nucleotide biến đổi là dideoxynucleotide (ddNTP) để làm dừng phản ứng tổng hợp DNA. Khi một ddNTP gắn vào chuỗi đang tổng hợp, quá trình kéo dài bị ngưng lại do không có nhóm -OH ở vị trí 3′. Nhờ gắn các ddNTP với chất huỳnh quang và phân tách bằng điện di mao quản, trình tự DNA được xác định dựa trên màu sắc và vị trí của các đoạn DNA kết thúc.

Quy trình giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger

• Tách chiết DNA từ mẫu sinh học.
• Chuẩn bị phản ứng PCR chứa primer đặc hiệu, dNTPs, ddNTPs huỳnh quang, DNA polymerase.
• Tiến hành tổng hợp chuỗi DNA dừng ngẫu nhiên.
• Điện di mao quản để phân tách các đoạn DNA.
• Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng.

Thiết bị sử dụng trong phương pháp Sanger

Các thiết bị cần thiết bao gồm: máy PCR, máy điện di mao quản (như ABI 3130/3500), máy ly tâm, máy vortex, tủ lạnh âm sâu và phần mềm phân tích chuỗi DNA như Chromas hoặc Sequence Scanner.

Hóa chất cần thiết

• ddNTPs gắn huỳnh quang (4 màu tương ứng A, T, G, C)
• dNTPs (bình thường)
• DNA polymerase
• Primer đặc hiệu
• Buffer, MgCl₂, nước không chứa DNase/RNase

Loại mẫu và yêu cầu mẫu

Mẫu có thể là máu ngoại vi, mô cố định paraffin (FFPE), dịch cơ thể hoặc tế bào nuôi cấy. DNA cần có độ tinh sạch tốt (tỷ lệ A260/A280 từ 1.8–2.0), nồng độ từ 10–50 ng/µL và không chứa chất ức chế PCR.

Phân tích kết quả

Sau khi điện di mao quản, kết quả hiển thị dưới dạng điện đồ huỳnh quang. Mỗi đỉnh màu đại diện cho một nucleotide. Trình tự được phân tích bằng phần mềm và so sánh với chuỗi tham chiếu để phát hiện đột biến điểm, mất đoạn hoặc chèn đoạn nhỏ.

Ứng dụng của phương pháp Sanger

• Chẩn đoán bệnh di truyền như Thalassemia, Huntington, Wilson…
• Xác định đột biến gen trong ung thư (EGFR, KRAS…)
• Xác minh kết quả từ NGS hoặc PCR
• Phân tích trình tự vector, plasmid, gen nhân tạo

Chuyên gia tư vấn: Nguyễn Phúc Duy

Chuyên gia Nguyễn Phúc Duy là một trong những người tiên phong triển khai kỹ thuật giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. Anh có hơn 10 năm kinh nghiệm trong sinh học phân tử và chẩn đoán gen, hiện đang công tác tại YCT Diagnostic – Cần Thơ. Anh từng đào tạo hàng trăm kỹ thuật viên, tư vấn kỹ thuật cho các dự án nghiên cứu ung thư và ứng dụng Sanger trong kiểm định đột biến gen đích.

Nếu bạn cần tư vấn chuyên sâu về giải trình tự gen hoặc triển khai hệ thống xét nghiệm, hãy liên hệ với anh Nguyễn Phúc Duy để được hỗ trợ tốt nhất.